COMO SE DETECTA EL GLUTEN EN LOS ALIMENTOS

Tres profesionales que se desempeñan en los laboratorios de la Universidad Nacional de Lanús (UNLa) explican detalladamente en qué consiste un ELISA, la técnica más utilizada para detectar la gliadina, una de las proteínas que contiene el gluten.

La enfermedad celíaca es un trastorno inmunológico (enfermedad autoinmune) producida por una proteína llamada gluten. Las personas que la padecen, al ingerir esta proteína, sufren una reacción inmunológica exacerbada contra el intestino, que les puede producir desde problemas gastroentéricos (imposibilidad de absorción de hierro y calcio, entre otras, hasta cuadros de desnutrición severos. Es por ello que la dieta debe ser libre de TACC (trigo, avena, cebada y centeno). La mayoría de los productos farináceos se elaboran con este tipo de harinas y, por lo tanto, el consumo de productos para celíacos debe ser controlado por un laboratorio certificado. El gluten está compuesto por dos proteínas: gliadina y glutenina. Esta última es la que produce el efecto sobre los pacientes.

Tanto en la Argentina como en el resto del mundo no existe un marco regulatorio consolidado para la detección de gluten. Sin embargo, la técnica más utilizada es el ELISA. La empresa alemana R-Biopharm elabora estos kits. ¿QUÉ ES UN ELISA?Un ELISA es un ensayo inmunoenzimático; es decir, un método que posee una alta especificidad y alta sensibilidad y que puede asegurar los resultados obtenidos, sean positivos o negativos. Si bien la glutenina es la proteína que produce la reacción autoinmune, tiene una relación directa y proporcional a la gliadina. Y es por ello que los kits se diseñan para gliadina.

¿Qué es un kit de ELISA para la detección de gliadina?

Primero se debe sensibilizar (pegar) con anticuerpos monoclonales (obtenidos de hibridomas) antigliadina en unos micropocillos .Aquí se colocará la muestra a analizar previamente tratada. El tratamiento de la muestra consiste en pesar 1 g de muestra y agregarle 10 ml de alcohol 60 %. El gluten se disuelve en el alcohol, se mezcla en un agitador durante treinta minutos y luego se centrifuga para bajar todas las partículas alimenticias. Por lo tanto, la gliadina disuelta en alcohol queda en el sobrenadante (parte liquida y superior de tubo). Se toma una pequeña fracción y se siembra en los micropocillos. Conjuntamente, para poder determinar la cantidad de gliadina presente se debe calibrar una curva. Para ello, el kit trae seis estándares de concentraciones conocidas de gliadina (0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppb). Cada uno de ellos también se siembra en los micropocillos. Una vez realizado esto se lo deja reposar durante treinta minutos. En esta etapa, si hay gliadina presente en las muestras se pegará a los anticuerpos que están adheridos en los micropocillos. Luego se lava con un buffer varias veces para eliminar los restos. El paso siguiente consiste en sembrar otro anticuerpo (que posee una enzima adosada) que se pegará a la gliadina ya adherida (treinta minutos), de aquí el nombre ELISA sándwich. Se vuelve a lavar y, por último, se agrega un sustrato para que funcione la enzima y un cromógeno (treinta minutos).

Si efectivamente las muestras analizadas tienen gliadina, las enzimas adheridas al segundo anticuerpo producirán una reacción que conjuntamente con el cromógeno dará un cambio de color. Este cambio de color es proporcional a la cantidad de gliadina. Para una correcta lectura de los datos, los micropocillos se deben colocar en un equipo (lector de ELISA) que mide la absorbancia de la luz transmitida y, de este modo, se obtienen los resultados.Luego, a través de un software específico se realizan los cálculos para la cuantifi cación de gliadina.

La especificidad y sensibilidad del método es superior al 99%. El limite de detección es de 5 ppm (partes por millón, es decir, 5 mg de gliadina por cada kg de alimento).Nosotros no consideramos aptos para celíacos a aquellos alimentos que posean un valor igual o superior a 5 ppm. En Europa están exigiendo hasta 15 ppm como libre de gluten y aquí 5 ppm. Es decir: somos mucho más exigentes en este punto. Además, hay que tener en cuenta que se utiliza el mismo kit comercial.Si bien esta metodología no es complicada, el personal que la realiza debe estar muy bien capacitado. El tiempo de análisis total oscila entre cuatro y cinco horas, en función de la cantidad de muestras. Lo que nosotros analizamos es el producto tal cual se vende. Siempre que el alimento tenga más de un componente y sea heterogéneo se debe tomar muestras de todos sus componentes. No corresponde realizar un análisis parcial de un alimento, en caso de que tenga diversos componentes, como puede ser el caso del alfajor, que tiene tapas, relleno y cobertura.Los productos llegan a nuestros laboratorios porque para aparecer en el libro de ACELA deben tener los análisis hechos en un laboratorio certificado. Pero, si bien nuestros laboratorios (UNLa) están certificados por ACELA, no somos un organismo de contralor. Además, la información de cada empresa es confidencial. Si el análisis les da positivo no pueden lanzar el producto a la venta y si es negativo nos piden que le faxeemos los resultados a ACELA. El INAL (Instituto Nacional de Alimentos) sólo publica aquellos productos que están libres de gluten.

MEDIDAS DE SEGURIDAD. Algunos aspectos a tener en cuenta a la hora de realizar los análisis.Es conveniente trabajar en cabinas de bioseguridad, ya que estos equipos filtran el aire. Particularmente, en nuestro laboratorio tenemos micropipetas que sólo se utilizan para realizar estos análisis. Tanto los operarios como todas las superficies de trabajo deben limpiarse con alcohol 70% para eliminar toda posibilidad de contaminación externa. Estos detalles son muy importantes ya que, si no se realizan estas medidas de control, las muestras pueden contaminarse y dar falsos positivos, algo perjudicial tanto para los productores como para los consumidores.El gluten no se destruye con el calor y es altamente contaminante y volátil (las personas lo pueden transportar en la piel, en la ropa y en los utensilios). Por eso, siempre debe utilizarse material descartable (tubos, tips, etcétera).

DATOS DE CONTACTO:Universidad Nacional de Lanús:6322-9200 int. 204 (de 10:00 a 18:00)www.unla.edu.ar

Licenciado Guillermo Guiria, Coordinador de laboratorios de la UNLa, profesor adjunto de Microbiología de Alimentos I y II. Licenciado en Ciencias Biológicas, Magister en Microbiología Molecular. (Siete publicaciones internacionales, numerosos congresos, dictado de cursos de capacitación a empresas multinacionales y a PyMES.) gguirin@unla.edu.ar

María Eugenia Passadore: Ingeniera Agrónoma, Técnica en Microbiología.mepassadore@unla.edu.ar Leandro Collivadino: Estudiante de tercer año en la licenciatura en Ciencias y Tecnología de los Alimentos, Ayudante de Microbiología I y II. laboratorio@unla.edu.ar

Fuente: Celi&Co. Edición Nº5

Un poco de diagnóstico de la EC

Aprovecho la profesión que ejerzo hace mas de 10 años , la Bioquímica, para dejar un pequeño aporte en cuanto al diagnóstico de la Enfermedad Celiaca(EC)..Muchas veces se encontrarán con los análisis en mano y se preguntaran y ahora??que significa todo esto Dr.???

Por esto les tratare de explicar de una forma sencilla de que se trata el diagnóstico serológico de esta patología, que es el que precede a la Biopsia de Intestino Delgado, único gold standard que nos afirma que el paciente es celíaco.

La serología o presencia de Anticuerpos en la enfermedad celiaca es fundamental en el screening , es decir la detección de casos de EC. Los anticuerpos que habitualmente solicitan los médicos son:

1. ANTIGLIADINA IgA e IgG( AGA)


2. ANTITRANSGLUTAMINASA IgA e IgG( ATG )


3. ANTIENDOMISIO IgA e IgG( EMA)


4. PEPTIDOS DEAMINADOS DE LA GLIADINA( DPG)

1. Los anticuerpos AGA se detectan habitualmente por un método que se denomina ELISA: simple, económico, semi cuantitativo.
Los de clase IgG son sensibles (95%) pero muy poco específicos (70%) . Esto significa que tienen gran cantidad de falsos positivos, es decir reacciones cruzadas con un gran numero de enfermedades como la giardiasis, síndrome post enteritis, diarrea persistente, Enfermedad de Chron, Síndrome de Sjogren, artritis reumatoidea, alergia a la proteína de la leche de vaca.
Los de clase IgA son muy sensibles, con una especificidad variable según la población a la que se aplique ( superior al 85-90% en pacientes con patología digestiva).
Actualmente se utilizan principalmente en menores de 2 años y para seguimiento del tratamiento .

2. Los anticuerpos antitranslgutaminasa AtTG generalmente tambien se detectan por técnicas de ELISA. La transglutaminasa es antígeno de los Antiendomisio.
Tienen una excelente sensibilidad (95%-98% )y especificidad ( 94%-95%). por lo que se usan habitualmente. Suelen dar falsos negativos en menores de 2 años, y en el caso que se detecten de tipo IgA, tambien dan negativos en las personas que cursan con una deficiencia de IgA serica.
Apropiados para el diagnóstico y seguimiento con DLG.

3.Los Anticuerpos Antiendomisio se relacionan estrechamente con el daño de la mucosa. Para detectarlos se suele usar la tecnica de inmunoflurescencia indirecta IFI, que tiene la desventaja de ser operador dependiente. La especificidad es discretamente inferior en adultos que en niños .Tienen una excelente correspondencia con las ATtG, así como también con el glod standard (BID). Son las pruebas de referencia del laboratorio.

4. Péptidos deaminados de la gliadina es el último método , recientemente desarrollado. Se detecta tambien por técnicas de ELISA. Los antigenos son péptidos sintéticos que incluyen los epitopes principales de unión al ac de la molécula nativa de gliadina. Tienen una sensibilidad 94% IgG y 95% IgA y una especificidad 100% IgG y 99% IgA . Comparado con ATG, los (DGP) tuvieron similar sensibilidad pero mayor especificidad .

Mas allá de que cualquiera de estos Anticuerpos de positivo, debe confirmarse con la BID para dar el diagnóstico definitivo de EC y para comenzar el tratamiento con la dieta libre de gluten(DLG).

En algunos casos la serología es negativa aún cuando el paciente presenta clinica compatible y/o epidemiología;si el médico lo considera necesario, puede solicitar la Biopsia de Intestino.

También existen los Estudios de predisposición genética de la enfermedad celíaca HLA DQ2 Y DQ8, que se utilizan generalmente en familiares de pacientes con EC, para descartar la posibilidad de que se desarrolle la misma patología. En general , si estos estudios dan negativos, la enfermedad se descartaría en el 99 % de los casos, aunque en los últimos años se esta observando que otros HLA estarían también involucrados con la EC. Por otro lado, si estos resultados son positivos no quiere decir que desarrolle la enfermedad en algún momento de su vida, solo nos indica que tiene una predisposición genética y se debe realizar un seguimiento de ese paciente año tras año.

Lina