COMO SE DETECTA EL GLUTEN EN LOS ALIMENTOS

Tres profesionales que se desempeñan en los laboratorios de la Universidad Nacional de Lanús (UNLa) explican detalladamente en qué consiste un ELISA, la técnica más utilizada para detectar la gliadina, una de las proteínas que contiene el gluten.

La enfermedad celíaca es un trastorno inmunológico (enfermedad autoinmune) producida por una proteína llamada gluten. Las personas que la padecen, al ingerir esta proteína, sufren una reacción inmunológica exacerbada contra el intestino, que les puede producir desde problemas gastroentéricos (imposibilidad de absorción de hierro y calcio, entre otras, hasta cuadros de desnutrición severos. Es por ello que la dieta debe ser libre de TACC (trigo, avena, cebada y centeno). La mayoría de los productos farináceos se elaboran con este tipo de harinas y, por lo tanto, el consumo de productos para celíacos debe ser controlado por un laboratorio certificado. El gluten está compuesto por dos proteínas: gliadina y glutenina. Esta última es la que produce el efecto sobre los pacientes.

Tanto en la Argentina como en el resto del mundo no existe un marco regulatorio consolidado para la detección de gluten. Sin embargo, la técnica más utilizada es el ELISA. La empresa alemana R-Biopharm elabora estos kits. ¿QUÉ ES UN ELISA?Un ELISA es un ensayo inmunoenzimático; es decir, un método que posee una alta especificidad y alta sensibilidad y que puede asegurar los resultados obtenidos, sean positivos o negativos. Si bien la glutenina es la proteína que produce la reacción autoinmune, tiene una relación directa y proporcional a la gliadina. Y es por ello que los kits se diseñan para gliadina.

¿Qué es un kit de ELISA para la detección de gliadina?

Primero se debe sensibilizar (pegar) con anticuerpos monoclonales (obtenidos de hibridomas) antigliadina en unos micropocillos .Aquí se colocará la muestra a analizar previamente tratada. El tratamiento de la muestra consiste en pesar 1 g de muestra y agregarle 10 ml de alcohol 60 %. El gluten se disuelve en el alcohol, se mezcla en un agitador durante treinta minutos y luego se centrifuga para bajar todas las partículas alimenticias. Por lo tanto, la gliadina disuelta en alcohol queda en el sobrenadante (parte liquida y superior de tubo). Se toma una pequeña fracción y se siembra en los micropocillos. Conjuntamente, para poder determinar la cantidad de gliadina presente se debe calibrar una curva. Para ello, el kit trae seis estándares de concentraciones conocidas de gliadina (0, 5, 10, 20, 40 y 80 ppb). Cada uno de ellos también se siembra en los micropocillos. Una vez realizado esto se lo deja reposar durante treinta minutos. En esta etapa, si hay gliadina presente en las muestras se pegará a los anticuerpos que están adheridos en los micropocillos. Luego se lava con un buffer varias veces para eliminar los restos. El paso siguiente consiste en sembrar otro anticuerpo (que posee una enzima adosada) que se pegará a la gliadina ya adherida (treinta minutos), de aquí el nombre ELISA sándwich. Se vuelve a lavar y, por último, se agrega un sustrato para que funcione la enzima y un cromógeno (treinta minutos).

Si efectivamente las muestras analizadas tienen gliadina, las enzimas adheridas al segundo anticuerpo producirán una reacción que conjuntamente con el cromógeno dará un cambio de color. Este cambio de color es proporcional a la cantidad de gliadina. Para una correcta lectura de los datos, los micropocillos se deben colocar en un equipo (lector de ELISA) que mide la absorbancia de la luz transmitida y, de este modo, se obtienen los resultados.Luego, a través de un software específico se realizan los cálculos para la cuantifi cación de gliadina.

La especificidad y sensibilidad del método es superior al 99%. El limite de detección es de 5 ppm (partes por millón, es decir, 5 mg de gliadina por cada kg de alimento).Nosotros no consideramos aptos para celíacos a aquellos alimentos que posean un valor igual o superior a 5 ppm. En Europa están exigiendo hasta 15 ppm como libre de gluten y aquí 5 ppm. Es decir: somos mucho más exigentes en este punto. Además, hay que tener en cuenta que se utiliza el mismo kit comercial.Si bien esta metodología no es complicada, el personal que la realiza debe estar muy bien capacitado. El tiempo de análisis total oscila entre cuatro y cinco horas, en función de la cantidad de muestras. Lo que nosotros analizamos es el producto tal cual se vende. Siempre que el alimento tenga más de un componente y sea heterogéneo se debe tomar muestras de todos sus componentes. No corresponde realizar un análisis parcial de un alimento, en caso de que tenga diversos componentes, como puede ser el caso del alfajor, que tiene tapas, relleno y cobertura.Los productos llegan a nuestros laboratorios porque para aparecer en el libro de ACELA deben tener los análisis hechos en un laboratorio certificado. Pero, si bien nuestros laboratorios (UNLa) están certificados por ACELA, no somos un organismo de contralor. Además, la información de cada empresa es confidencial. Si el análisis les da positivo no pueden lanzar el producto a la venta y si es negativo nos piden que le faxeemos los resultados a ACELA. El INAL (Instituto Nacional de Alimentos) sólo publica aquellos productos que están libres de gluten.

MEDIDAS DE SEGURIDAD. Algunos aspectos a tener en cuenta a la hora de realizar los análisis.Es conveniente trabajar en cabinas de bioseguridad, ya que estos equipos filtran el aire. Particularmente, en nuestro laboratorio tenemos micropipetas que sólo se utilizan para realizar estos análisis. Tanto los operarios como todas las superficies de trabajo deben limpiarse con alcohol 70% para eliminar toda posibilidad de contaminación externa. Estos detalles son muy importantes ya que, si no se realizan estas medidas de control, las muestras pueden contaminarse y dar falsos positivos, algo perjudicial tanto para los productores como para los consumidores.El gluten no se destruye con el calor y es altamente contaminante y volátil (las personas lo pueden transportar en la piel, en la ropa y en los utensilios). Por eso, siempre debe utilizarse material descartable (tubos, tips, etcétera).

DATOS DE CONTACTO:Universidad Nacional de Lanús:6322-9200 int. 204 (de 10:00 a 18:00)www.unla.edu.ar

Licenciado Guillermo Guiria, Coordinador de laboratorios de la UNLa, profesor adjunto de Microbiología de Alimentos I y II. Licenciado en Ciencias Biológicas, Magister en Microbiología Molecular. (Siete publicaciones internacionales, numerosos congresos, dictado de cursos de capacitación a empresas multinacionales y a PyMES.) gguirin@unla.edu.ar

María Eugenia Passadore: Ingeniera Agrónoma, Técnica en Microbiología.mepassadore@unla.edu.ar Leandro Collivadino: Estudiante de tercer año en la licenciatura en Ciencias y Tecnología de los Alimentos, Ayudante de Microbiología I y II. laboratorio@unla.edu.ar

Fuente: Celi&Co. Edición Nº5

Sobre gluten, prolaminas, ppm y otras yerbas......

Amigos de la web...hoy quiero dejarles una entrada que tiene que ver con las inquietudes que nos surgieron a partir de la Dieta libre de Gluten, que tanto tiempo ocupa nuestros pensamientos a quienes debemos seguirla en forma estricta. A medida que Male comenzó con la DLG, comprendimos los conceptos de alimentos seguros, alimentos permitidos y alimentos prohibidos, pero luego nos invadió la preocupación por la "contaminacion cruzada"... ! Por momentos, se tornaba una persecución infernal, las migas que caen en la mesa, las que caen al piso y Male vive jugando en el suelo!!, las servilletas llevan las migas de aquí para allá! La esponjita de lavar..si lavo con la misma que lavo otros utensilios ..cuanto gluten habrá quedado?? Si a esto le sumamos la preguntita indiscreta.. "para tanto es..??".."Pero una miguita..que le hace??". Bueno, para este punto ya estamos desbordados...!!!. A quien no le ha pasado en sus comienzos, no??. Por todo esto es que decidí tratar de incluir algunos conceptos que ayuden comprender un poco mas estas incognitas ¿cuanto gluten me puede hacer mal cuando estoy frente a un hecho de contaminación cruzada?, ¿Me puedo permitir un margen de consumo de gluten?? ... Bueno, allá vamos...me acompañan?

Primero tenemos que conocer algunos términos de uso frecuente:

el Gluten se define como la fracción de proteína procedente de trigo, centeno, cebada, [avena], o sus variedades cruzadas y respectivos derivados. Mientras que las Prolaminas se definen como la fracción de gluten que puede extraerse con un 40–70 por ciento de etanol. La prolamina del trigo es la gliadina, que representa el 80 % de las proteínas del trigo, la del centeno la secalina, la de la cebada la hordeína y la de la avena la avenina. Sin embargo habitualmente se habla de sensibilidad al gluten. El contenido de prolamina del gluten se suele cifrar en un 50 %. Es importante tener en cuenta que pequeñas cantidades de gliadina pueden tener repercusiones distintas, dependiendo de la sensibilidad individual de cada celiaco.

La unidad que se utiliza para expresar la concentración de gluten en los alimentos que se analizan, son las “partes por millon”, podemos decir que es una unidad que se usa para valorar la presencia de elementos en pequeñas cantidades (traza) en una mezcla ( 1 mg/kg equivale a 1 ppm).

El Codex Alimentarius ( FAO/OMS) es una normativa que no tiene carácter de ley, y aunque hay varios países que se rigen por él, la legislación se adecua en cada país. La Norma Stan 118-1979, enmendado en 1983 y revisado en 2008 define dos categorías:

1. Alimentos exentos de gluten, cuyo contenido de gluten no sobrepasa los 20 mg/kg( 20 ppm)

2. Alimentos procesados de forma especial para reducir el contenido de gluten a un nivel comprendido entre 20 mg/kg y 100 mg/kg. Estos alimentos están constituidos por uno o más ingredientes procedentes del trigo (es decir, todas las especies de Triticum, como el trigo duro, la espelta y el kamut), el centeno, la cebada, la avena o sus variedades híbridas que han sido procesados para reducir el contenido de gluten.

En nuestro país, el Código Alimentario Argentino( C.A.A) en el articulo 1382 bis del Capitulo XVII , establece que se entiende por "alimento libre de gluten" aquel que está preparado únicamente con ingredientes que por su origen natural y por la aplicación de buenas prácticas de elaboración — que impidan la contaminación cruzada— no contiene prolaminas procedentes del trigo, de todas las especies de Triticum, como la escaña común (Triticum spelta L..), kamut (Triticum polonicum L.), de trigo duro, centeno, cebada, avena ni de sus variedades cruzadas.
Para comprobar la condición de libre de gluten deberán utilizarse aquellas técnicas que la Autoridad Sanitaria Nacional evalúe y acepte.

Actualmente el Instituto Nacional de Alimentos considera alimentos libres de gluten a aquellos cuyo contenido no supere los 10 mg/kg de gluten o 5 mg / kg de gliadina.

Pero volvamos a lo que nos convoca, el tema de la contaminación cruzada. Aún no existe en la actualidad un consenso de carácter internacional acerca de la cantidad máxima de gluten que puede tolerar un paciente celiaco. Esta dificultad para lograr el consenso se debe a la gran variabilidad individual que se observa en la sensibilidad al gluten de los pacientes con esta patología.
Las reacciones al gluten no son sólo influenciadas por la cantidad, sino también por la calidad de la proteína ingerida, que puede cambiar de acuerdo con la variedad del cereal y el procesamiento del alimento (puro contra granos cocidos, fermentación, etc.)

Los efectos de una ingesta baja en pacientes celíacos han sido investigados en un limitado número de estudios.
Entre los años 2001 y 2004, en Italia, el Dr. Catassis y col. , realizaron un estudio prospectivo, doble ciego, placebo controlado, con el objetivo de establecer el umbral de seguridad de la exposición prolongada a trazas de gluten , como es el caso de la contaminación. Para ello sometieron a pacientes con DLG a ingerir diariamente durante 90 días capsulas con diferentes contenido de gluten ( 0, 10, 50 mg de gluten) . Después de completar los tres meses de desafío se realizó a los pacientes los mismos exámenes clínicos, serológicos e histológicos que al inicio del estudio. Se observó por los resultados que arrojaron las biopsias, que la continua ingesta de gluten, sea o no en forma voluntaria, causa inflamación del intestino .
El desafío de gluten mostró además una amplia variabilidad individual en la sensibilidad a las trazas de gluten, pero también demostró con su estudio que 50 mg de gluten/día durante 3 meses es suficiente para causar una alteración en la relación vellosidad/cripta del intestino en estos pacientes. Ya que en este estudio se realizó con pocos pacientes, no se pudo llegar a conclusiones acerca de la potencial toxicidad de 10 mg/día de gluten.
De todos modos, los hallazgos deberán ser cuantificados y confirmados por estudios más amplios en un mayor número de pacientes celíacos, mientras que la relación del daño intestinal por la ingestión de trazas de gluten y las complicaciones a largo plazo aún no se conocen y deberán seguir su estudio.
Es por todo esto que existe en la actualidad mucha controversia acerca de la cantidad de gluten que puede tolerar una persona celíaca, y por eso aún es materia de debate el umbral por debajo del cual las personas celiacas estarían seguras. La decisión acerca de que umbral , depende no sólo de la dosis mínima que resulta tóxica para el organismo, sino también de la cantidad de productos libres de gluten que se consumen, y esto desde ya, está ligado a los habitos alimentarios de cada individuo.

Bueno amigos, con esto tan solo quería, familiarizarlos con algunos términos frecuentes, que confunden y suman al desconcierto inicial. Y a pesar que hay muchas incógnitas aún sin develar, existen profesionales, cinetíficos e investigadores en todo el mundo , que trabajan día a día para encontrar en un futuro las respuestas y que todos así podamos tener una mejor calidad de vida.

GRACIAS A ROLANDO Y A NOEMI !!!!!!